蛋白质定量试剂盒 (BCA 法)

描述：Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理与Lowery法蛋白定量相似， 即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+ 。BCA与Cu1+ 结合形成稳定的紫蓝色复合物，在 562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的紫蓝色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与   Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。

组成与储存：

(1) BCA Reagent 100 ml，室温保存；

(2) Cu Reagent 2 .5ml，温保存；

(3) BSA standard 4 mg/ml 1 ml，-20ºC 冻存。12 个月有效。可进行 500 次微板(microplate)测定或 100 次 1 ml 比色杯测 定。

所需设备：

比色计、酶标仪或微板比色仪，最佳工作波长562 nm，可在 540-590 nm 之间。

工作溶液(Working Reagent, WR)配制：

将50 体积 BCA Reagent 与 1 体积 Cu Reagent 混合即为 WR 工作试剂，呈嫩绿色；室温 1 周内稳定。

标准蛋白溶液配制：

用双蒸水、0.9%生理盐水、PBS 或与待测蛋白样品匹配的缓冲液进行倍比稀释: 20 µl 4000 µg/ml BSA + 30 µl 稀释溶液(H2O/PBS/0.9%NaCl) = 50 µl (BSA=1600 µg/ml)，从中取 25 µl 连续   倍比稀释，得到 BSA 标准溶液 1600、800、400、200、100、50、25 µg/ml，各 25 µl 。通常，样品蛋 白浓度不会太高，也可以预先稀释待测样品，可以省略 1600 µg/ml 标准管而直接从 800 或 1000 µg/ml   开始，能节省标准蛋白用量。

蛋白浓度测定：

蛋白质浓度线性检测范围为10-2000 µg/ml。标准测定时，用 1 cm 光程玻璃或塑料比色皿，反应终体积

1.1 ml ，比色计测定。微板测定时，用 96 孔板，反应终体积 225 µl ，用酶标仪、微板比色仪测定。

1.    标准测定：将0.05~0.1 ml 标准品或待测样本与 1 ml WR 工作溶液混合。

       微板测定：将25 µl 标准品或待测样本与 200 µl WR 工作溶液混合。

2.    37ºC 反应 30min；也可 25ºC 室温 2 小时或过夜。60ºC 30 min 反应可增加检测灵敏度至 5-250µg/ml。

3.    将反应管冷却至室温。测定562 nm (可在540-590 nm之间)光密度(OD)值。4.    绘制标准曲线。X轴为BSA标准蛋白浓度(mg/ml或µg/ml)，Y轴为各标准管对应的OD562值。用Excel 拟合曲线并计算蛋白浓度。

表1   标准测定和微板测定方案的加样量和比例

注意事项

1.    37ºC   30min 或 25ºC 室温反应 2 小时对测量较为便利，但严格来讲此时反应尚未达到终点，通常每

10 min OD562 值升高约2.3%。然而，通常在 10min 内可以测定 30 管并不会明显影响测定精度。

2.    BCA 法检测范围为 20-2000 µg/ml。检测 0.5~10 µg/ml 高度稀释蛋白样品应采用 Bradford 法蛋白质定量试剂盒(# P1510) 。60ºC 30 min 反应可增加检测灵敏度至 5~250µg/ml。

3.    BCA法检测样品中含有脂类物质时光吸收值会偏高。样品中EDTA或葡萄糖浓度大于10 mM不能使用 BCA方法，葡萄糖浓度大于10 mM时可用改良Lowry法蛋白定量试剂盒，EDTA大于10 mM 的样品可用Bradford法蛋白质定量试剂盒。另外，蛋白质样品经液体样品蛋白抽提试剂沉淀后，可彻底去除干扰BCA法、Bradford法、和Lowry法蛋白测定的物质。

4.    欲使测量能耐受下面表 2 所提示的最大干扰物质浓度，并保持测量精度，应在蛋白标准管中加入相 应浓度的干扰物质，但会给操作带来不便。

5.    可测量吸附于固相支持物乳酶标板、琼脂糖、亲和层系凝胶上的蛋白。

6.    每次测定应该重新测定并制作标准曲线。

参考文献：

Smith P et al, 1995, Measurment of protein using bicinchiconic acid, Anal. Biochem. 150, 76-85

表2   BCA法物质干扰及耐受的最大浓度